Как и в шутерах от первого лица, игровой процесс которых похож на Doom, в Duke Nukem 3D нужно перемещаться по уровням, представленным с точки зрения главного героя, и по пути стрелять во врагов. Окружающая среда в Duke Nukem 3D очень разрушаема и интерактивна; большинство объектов может быть уничтожено игроком. Уровни были спроектированы довольно нелинейно, так что игроки могли с выгодой для себя использовать вентиляционные каналы, задние двери и канализацию, чтобы избегать врагов или находить тайники. В этих локациях также много объектов, с которыми игрок может взаимодействовать. Некоторые из них дают игроку игровые преимущества: выключатели света облегчают видимость, а фонтаны и сломанные пожарные гидранты восстанавливают здоровье. Другие объекты служат просто для отвлечения внимания. Чаевые стриптизершам вызывают цитату Дюка и провокационное разоблачение со стороны танцовщицы. Арсенал Дюка состоит из «Могучей ноги» (базовой атаки ударом), пистолета, дробовика, трехствольной пулеметной установки, реактивного гранатомета, трубных бомб, замораживающего устройства и сжимающих лучей, лазерных противопехотных мин и скорострельной ракетной установки «Опустошитель». В версии игры Atomic Edition также есть «Расширитель» — оружие, противоположное по принципу действия лучевой пушке. Наконец, в версии игры 20th Anniversary World Tour также есть «Инсинератор» — оружие, противоположное по принципу действия замораживающему пистолету (с огненными снарядами вместо ледяных).